【摘要】 　　目的 探讨U0126、SB203580、PD98059和LY294002对体外缺氧状态下人肺癌细胞A549侵袭力的影响。方法 由DFOM建立缺氧环境，U0126、SB203580、PD98059和LY294002处理A549细胞，采用细胞培养、BD细胞培养小室、Giemsa染色和免疫细胞化学染色等方法，检测细胞侵袭力的变化和Ecadherin蛋白的表达。结果 A549细胞在缺氧状态下高侵袭力24h后即受到抑制剂明显抑制，其中以PD98059的作用最显著；Ecadherin蛋白的表达也明显上调。结论 U0126、SB203580、PD98059和LY294002具有抗肿瘤侵袭的作用，具体机制有待于进一步研究。 【关键词】 人肺癌细胞系A549　缺氧　蛋白激酶抑制剂　肿瘤侵袭 　　研究表明，缺氧是导致肿瘤浸润和转移能力提高的主要因素，研究体外缺氧状态下癌细胞侵袭力的变化可有助于找到对抗肿瘤侵袭转移的途径。蛋白激酶是一类调节细胞生长和死亡的重要细胞信号系统，为探讨蛋白激酶抑制剂U0126、SB203580、PD98059和LY294002对体外缺氧状态下A549细胞侵袭力的影响，本实验由DFOM(Deferoxamine Methanesulfonate salt 或Desferrioxamine Mesylate salt,甲磺酸去铁胺)建立肿瘤细胞的缺氧环境〔1，2〕，采用细胞培养、BD细胞培养小室、Giemsa染色和免疫细胞化学染色等方法，观察U0126、SB203580、PD98059和LY294002对体外缺氧状态下的人肺腺癌细胞A549的侵袭力的影响，同时检测上述不同培养条件下A549细胞Ecadherin蛋白的表达情况。 　　1 材料和方法 　　11 材料 人肺腺癌细胞A549细胞株；常规培养基：含10%胎牛血清和青/链霉素的DMEM培养基（称为R培养基）；DFOM（Sigma，D9533）：使用时在R培养基中加DFOM至终浓度为100 μmol/L，为保证DFOM的浓度，每24 h换液一次（称D培养基）；蛋白激酶抑制剂U0126（CALBIOCHEM，662005）、SB203580（CALBIOCHEM，559389）、PD98059（CALBIOCHEM，513000）、LY294002（CALBIOCHEM，440202）使用时均溶于DMSO，终浓度均为20 μmol/L；BD细胞培养小室（BD FalconTM Cell Culture Insert Companion Plates，Cat: 353504）。 　　12 细胞爬片的制备 人肺腺癌细胞A549以1×105的浓度接种于直径35 cm的培养皿中，皿内预置盖玻片，培养基为R培养基,在37℃，5%CO2培养箱中培养。待细胞覆盖面积达40%时，开始分组并记时。对照1组（常氧）弃去培养液，盖玻片冷PBS洗涤、80%酒精固定30 min后，待免疫细胞化学染色。对照2组（缺氧）换用D培养基、实验组换用加入上述各蛋白激酶抑制剂的D培养基，每24 h观察一次并更换培养基，至72 h后弃去培养液，余同上步骤，待免疫组化染色。 　　13 Ecadherin免疫细胞化学染色 对上述不同培养条件下的细胞爬片进行Ecadherin免疫细胞化学染色，SP法，DAB显色。Ecadherin（鼠抗人单克隆抗体）和SP试剂盒购自福州迈新生物技术公司。 　　14 体外侵袭力测定 将A549细胞调节至浓度5×104/ml，接种于BD小室内，每小室加入液量为250 μl。对照1组采用R培养基，对照2组采用D培养基，实验组采用分别加入U0126、SB203580、PD98059和LY294002的D培养基。此外，还增加了采用R培养基+DMSO、D培养基+DMSO以及加入上述各蛋白激酶抑制剂的R培养基作为对照；培养24 h后取出小室，用棉棒擦净未穿透微孔滤膜的细胞，80%酒精固定15 min，双蒸水冲洗。取下微孔滤膜，在显微镜下计数细胞数。 　　15 统计学分析 数据均以x±s表示, 采用SPSS 115统计软件，t检验。 　　2 结果 　　21 形态学观察 对照1组可见A549细胞聚集形成集落，细胞分裂易见。加入DFOM 72 h后对照2组已几乎看不到细胞集落，细胞之间几乎完全分离，呈散射状；而各实验组72 h时，仍可见到细胞集落的存在。 　　22 Ecadherin免疫细胞化学染色 Ecadherin蛋白表达于细胞膜上。对照1组Ecadherin蛋白呈深棕色强表达，形成清晰的蜂巢样结构；对照2组Ecadherin蛋白表达呈浅棕色，弥散而不清晰；实验组Ecadherin蛋白表达呈浅棕色，略弥散，但仍可见到一些较清晰的线样、蜂巢样结构，尤其在加入PD98059组表现明显(图1)。 　　23 细胞体外侵袭力测定结果 通过微孔滤膜的细胞数计数结果见表1。与对照1组比较，对照2组的细胞数显著增多(P＜001)；与对照2组比较，在D培养基内分别加入U0126, SB203580, PD98059, LY294002后穿过微孔滤膜的细胞数显著下降(P＜001)。 　　图1 Ecadherin免疫细胞化学染色(200×)（略） 　　表1 U0126、SB203580、PD98059和LY294002对体外缺氧状态下A549细胞的影响（略） 　　与对照1组比较：1)P＜001，与对照2组比较：2)P＜001 　　3 讨论 　　缺氧是恶性肿瘤发生、发展过程中的普遍现象，也是导致肿瘤侵袭和转移能力提高的主要因素。本实验由DFOM建立A549细胞缺氧环境后，细胞的集落形成能力逐渐减弱；侵袭力分析结果显示，与常氧环境相比，A549细胞在缺氧环境24 h后侵袭力显著增强，表现为高侵袭力，提示缺氧可提高侵袭能力。本实验结果显示：由U0126、SB203580、PD98059和LY294002分别处理细胞后，DFOM导致的A549细胞的高侵袭力24 h后即受到明显抑制，其中以PD98059的作用最显著。 U0126、SB203580、PD98059和LY294002分别是MEK1,2、p38丝裂原活化蛋白激酶、丝裂原活化蛋白激酶激酶1和PI 3激酶的特异性抑制剂，都属于细胞内丝裂原活化蛋白激酶的抑制剂，通过特异性地抑制丝裂原活化蛋白激酶阻断细胞间的信号转导。细胞内丝裂原活化蛋白激酶是细胞内的一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，是一个非常重要的细胞内信号传导酶超家族,是介导细胞反应的重要信号系统，调节机体细胞的生长、分化、分裂、死亡,以及细胞间的功能同步等多种过程。细胞信号传导是癌细胞所有生命活动的基础，利用蛋白激酶抑制剂抑制一些癌细胞的信号被认为是抗肿瘤的有效途径〔3，4〕 。一些蛋白激酶抑制剂通过抑制癌细胞的某些信号转导已经显示很好的抗肿瘤作用，一些临床实验试验也已经进行〔5，6〕，这些抑制剂的抗癌机制正在被广泛研究中。本实验中这些蛋白激酶抑制剂抑制缺氧所致A549细胞高侵袭力的机制可能与Ecadherin 有关。Ecadherin即上皮钙黏蛋白，对维持细胞形态、细胞运动及黏附功能具有重要作用，是一种与肿瘤细胞的浸润、转移相关的细胞黏附分子，其表达下降或缺失的肿瘤细胞表现出侵犯转移特性〔7〕。本实验中，Ecadherin蛋白的表达与侵袭力有一定的负相关：A549细胞在体外缺氧状态下Ecadherin表达下调，侵袭力增强；上述蛋白激酶抑制剂处理细胞后，侵袭力降低，而Ecadherin 蛋白表达虽然与常氧组相比仍然较弱，但与单纯缺氧组相比有明显上调，已形成较清晰的线样、蜂巢样结构。提示A549细胞在缺氧以及上述各蛋白激酶抑制剂作用下，Ecadherin蛋白参与了肿瘤细胞侵袭力的调整变化过程，甚至可能是重要角色，但具体机制还需要进一步探讨。蛋白激酶抑制缺氧所致细胞高侵袭力的机制还可能与其他机制有关。Tan等〔8〕用MEK抑制剂U0126处理细胞后，可明显诱导细胞细胞连接跨膜蛋白occludin的表达。另有报道〔9〕用p38特异性抑制剂可明显减少uPAuPAR基因和蛋白的表达,抑制BT549细胞的侵袭能力。近年来伴随肿瘤分子生物学、肿瘤基因组的研究逐步深入，对肿瘤发生发展分子机制的进一步阐明，以及新的信号转导拮抗剂的发现，信号转导治疗作为一种新的抗肿瘤方法将有望逐步走向成熟并应用于临床。 【参考文献】 　　1 An WG, Kanekal M, Simon MC，et al Stabilization of wildtype p53 by hypoxiainducible factor 1alpha〔J〕Nature, 1998；392(6674):4058 　　2 Gross J, Fuchs J, Machulik A,et al Apoptosis, necrosis and hypoxia inducible factor1 in human head and neck squamous cell carcinoma cultures〔J〕 Int J Oncol, 2005；27(3):80714 　　3 毛志强,项伟中,俞 雁,等蛋白酪氨酸激酶小分子抑制剂研究进展〔J〕中国药物化学杂志，2005;15（2）：1218 　　4 何少峰靶向细胞信号网络的联合疗法:癌症治疗的新概念〔J〕国外医学·药学分册，2005;32（3）：14951 　　5 陈 敏,钟 刚,郑红兵,等PD98059对乳腺癌细胞的抗癌效应〔J〕医药导报，2005;24（6）：4579 　　 6 宋霆婷，姜玉华，李妙玉,等PD98059对肝癌细胞RasMAPK信号转导的作用〔J〕实用医学杂志，2005;21（5）：4468 　　 7 Imai T,Horiuchi A,Wang CJ,et alHypoxia attenuates the expression of Ecadherin via upregulation of SNAIL in ovarian carcinoma cells〔J〕 Am J Pathol, 2003;163:143747 　　8 Tan X, Tamori Y, Egami H,et alAnalysis of invasionmetastasis mechanism in pancreatic cancer: involvement of tight junction transmembrane protein occludin and MEK/ERK signal transduction pathway in cancer cell dissociation〔J〕 Oncol Rep,2004;11:9938 　　9 Huang S, New L, Pan Z, et al Urokinase plasmmogen activator/urokmasespecific surface receptor expression and matrix invasion by breast cancer cell requires constitutive p38 alpha mitogenactivated protein kinase activity 〔J〕J Biol Chem, 2000;27 (16):1226672